产品用途

ReverTra Ace®qPCR RT试剂盒(Code No.FSQ-101)采用了本公司高性能逆转录酶『ReverTra Ace®』，反应效率非常出色。另外，通过改良，使得带入到Realtime PCR反应体系中的逆转录反应液的影响降到最小，即使在PCR反应体系中添加20％体积的逆转录反应液，也能表现出良好的扩增线性。因此，最适合用于表达量较少的mRNA的高灵敏度检测。由于精简了试剂盒的构成，可非常简便地进行操作。

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产品特征

1.模板RNA量的添加量对合成效率影响的探讨

在ReverTra Ace® qPCR RT Kit的反应体系(10μl)中，分别添加HeLa细胞来源的total RNA 0.5μg - 0.5pg，分别进行逆转录反应。然后，采用和实验例2同样的方法进行cDNA合成量的比较。结果可见，在探讨的范围内，模板RNA的量和cDNA的得率密切相关，但无论模板RNA量的多寡，仍可维持很高的cDNA合成效率。由此可见，在目的片段浓度有差异的样品之间，逆转录反应效率的变化并不大，因此可将定量结果的误差控制在最小范围内。

2.与用其他公司产品cDNA合成量的比较 以来源于HeLa细胞的total RNA 100ng为模板，根据各公司试剂盒推荐的条件进行逆转录反应。然后，在Realtime PCR反应液(使用本公司SYBR Green Realtime PCR Master Mix)中分别添加上述的逆转录反应液各1% (V/V)，用Realtime PCR对β-Actin和Polymerase ε的cDNA量进行定量。结果可见，在使用本试剂盒的情况下，两个目的片段都有最高的得率。

3. RNase H 处理与否对检测灵敏度影响的比较 以来源于HeLa细胞的total RNA 100ng为模板，使用ReverTra Ace® qPCR RT Kit（蓝线）及另外添附RNase H的B公司cDNA合成试剂盒，按各自推荐的实验步骤进行逆转录反应(B公司试剂盒分别按RNase H处理（红线）/未处理（橙线）两种方法进行)。然后，按和实验例1同样的方法检测β-Actin的扩增效果。结果显示，用B公司的试剂盒RNase H未处理（橙线）的情况下，检测效果大幅下降。而用ReverTra Ace® qPCR RT Kit（蓝线）进行反应，即便不追加RNase H处理也能显示出很高的扩增效率。已经过实验证明，用本试剂盒RNase H处理与否灵敏度相等。 ※本试剂盒不包含RNase H处理步骤。

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参考文献

[FSQ-101]

5x RT Buffer 400μl

Enzyme Mix 100μl

Primer Mix 100μl

Nuclease-free Water 1000μl×2支

※试剂盒均为10μl反应体系情况下，可以使用200次。

[FSQ-101]
将RNA置于65℃，5min.
↓
置于冰上

灭菌蒸馏水 X μl
5x RT Buffer 2 μl
Enzyme Mix 0.5 μl
Primer Mix 0.5 μl
RNA 0.5pg～1μg
Total Volume 10 μl
↓
37℃, 15min.
98℃, 5min.

几点建议

●反应时间延长的效果

像tRNA等含量较多的RNA全部进行逆转录反应时，延长反应时间可提高得率，但一般情况下推荐37℃15分钟可得到足够的cDNA。

●可以使用的模板RNA的种类

Total RNA、mRNA、tRNA、rRNA等各种RNA都可以使用。

●无需RNase H处理

由于模板RNA的残留会对PCR产生抑制作用，一般情况下，逆转录反应结束后需通过RNase H对模板RNA进行分解。但本试剂盒采用了本公司新开发的体系，模板RNA在逆转录反应后通过非酶方法去除（正在申请专利），因此逆转录反应后无需进行RNase H处理。

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