让IVD产业不再受假阳性及假阴性的困扰！

【产品描述】

    本产品可在单管内同时进行高灵敏高重复的多重RT-qPCR分析，可以同时检测五种RNA及DNA靶标。本产品酶体系中包含高速高灵敏热启动TOROIVD^®5G DNA 聚合酶、高温活性TOROIVD^®III逆转录酶、RNase抑制剂，特别适合低拷贝RNA病毒的检测，检测敏感度最低可达5拷贝以下。另外酶混液中的热敏UNG酶、微量热敏双链DNA核酸酶及缓冲液中的dUTP构成强有力的污染清除系统，可有效清除扩增实验室的气溶胶污染。人工进化的酶系统及反应缓冲系统的优化，大大增强了酶系统的抗抑制能力，可应用于免提取RT-qPCR分析检测用途。

【产品特征】

   -高速高灵敏

本试剂可进行高速PCR分析，配合高速PCR仪时间可以缩短到30min以内，适合分子POCT用途。本试剂可对5拷贝以下的RNA病毒进行高灵敏RT-qPCR分析，最大避免检测假阴性。

-适合多重RT-qPCR

本试剂已经验证可进行五重RT-qPCR分析，实现单管内同时分析多个靶标或内标，降低试剂成本及提高分析效率。

-直接RT-qPCR

本试剂中含有高抗抑制能力强的改造型聚合酶，结合调优过的反应缓冲系统，可以根据不同的样品类型开发RNA免提取的直接RT-qPCR系统，从而缩短检测时间。

-强防污染能力

采用热敏UNG酶和微量热敏双链DNA核酸酶双酶系统构成强有力的污染清除系统，可有效清除气溶胶中PCR扩增产物污染，最大程度避免检测假阳性。

【产品组成】

本产品标准包装可以25µl反应体系进行400次检测，主要包含如下两部分组成：

备注：

  -RT-qPCR Enzyme Mix UD包含热敏UNG酶, dsDNase酶，TOROIVD®III逆转录酶, RNase抑制剂和 TOROIVD®5G DNA聚合酶.

  -2×5G qPCR Buffer BB 包含0.4mM dA/C/G/T/UTP, 5mM Mg2+, PCR反应缓冲液及稳定剂.

  -试剂应在-20°C存储，工业客户可以根据实际情况订制大包装的单独成分。

【储存条件及有效期】

  试剂盒-20℃冷冻保存，有效期24个月。运输过程中，温度应低于-15℃到-25℃冷链。

 试剂开封后，置于4℃条件下保质期为30天，-20℃条件下保质期为12个月，但反复冻融不得超过5次。2×5G qPCR Buffer BB请室温完全融化后使用，否则会降低使用效果。

【产品拓展】

在某些特定工业用途下，可以单独订购如下组分对QPR-303UD进行拓展使用。

备注:

-QPR-303UD中的 RT-qPCR酶混合液每25μl反应体系中的标准添加量为1.3μl。如果添加量想提高到1.5μl或2.5μl时，添加其它组分会影响酶的热稳定性。直接用本公司另外提供的0.2μl或1.2μl时酶混合液稀释液稀释（货号：END-UD13）可以有效保持该酶混合物的热稳定性。

-2×5G qPCR Buffer GB 针对提纯的RNA具有更高的灵敏度和特异性，某些实验场合可以代替2×5G qPCR Buffer BB使用具有更好的效果。但2×5G qPCR Buffer BB 具有更高的抗抑制能力。

-50×ROX 参比染料在需要参比染料的仪器上使用可以提高检测的重复性及稳定性，使用浓度为1×或0.1×，请根据仪器使用说明使用。

【应用案例】

实验案例一：2-3 拷贝SARS-CoV-2 RNA的高灵敏检测

RNA模板:

SARS-CoV-2 RNA标准物质（GBW（E）091111）；

N基因e：2.4×10⁵拷贝/ul; ORF1ab 基因：0.70×10⁵拷贝/ul;按10³，10⁴，10⁵和10⁶稀释

引物和探针：中国CDC推荐

ORF1ab-F：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 终浓度：300nM

ORF1ab-R：ACGATTGTGCATCAGCTGA  终浓度：300nM

ORF1ab-P: FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1  终浓度：100nM

N-F:  GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT  终浓度：600nM

N-R:  CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-  终浓度：600nM

N-P: FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA  终浓度：200nM

仪器设备：

杭州博日Line Gene 9600 Plus

结论：本试剂可对稳定检测2-3拷贝SARS-CoV-2 RNA，具有优异的试剂性能。

实验案例二：与N公司竞品灵敏度比较  

RNA模板:

   ORF1ab基因使用 2.25copies /反应，25ul反应体系；20个重复。

   N基因使用 2.25copies /反应，25ul反应体系；20个重复。

仪器设备：

ABI 7500

本产品（20/20，ORF基因 100%检出）    N公司（14/20，ORF基因 70%检出）

本产品（20/20，N基因 100%检出）   N公司（13/20，N基因65%检出）

 结论：本试剂可对稳定检测2-3拷贝SARS-CoV-2 RNA，保持具有100%的检出率。 和N公司竞品相比具有更高的灵敏度，且低拷贝时具有更高的荧光信号及更低的ct值。

实验案例三： 与T公司性能比较及产物污染去除能力验证

 模板与试剂: 采用QPR-303UD与T公司扩增Ms2RNA（Roche），做性能比较。QPR-303UD扩增的PCR产物进行纯化作为模板，使用不含UNG酶及核酸酶的QPR-303及QPR-303UD进行扩增。

引物和探针：

 上游引物:GCCTTAGCAGTGCCCTGTCT  400nM

 下游引物:AACATGCTCGAGGGCCTTA  400nM

 探针:FAM-CCCGTGGGATGCTCCTACATGTCA-TAMRA 200nM

仪器设备：

CFX 96

 
   绿色：QPR-303UD 红色：T公司    绿色：QPR-303 蓝色：QPR-303UD

  结论：QPR-303UD比T公司试剂具有更高灵敏度，尤其低拷贝模板荧光信号更高且Ct值更低。QPR-303UD具有完全去除Ct值为30之上的含U的PCR产物核酸污染能力，且不对产品扩增性能有任何影响。

实验案例四： QPR-303UD的酶预混液的热稳定性验证

 模板:  采用MS2RNA及如上配套引物探针组合进行热稳定性验证性能。

 实验组：

A： QPR303UD13 酶混合液，分别在-20℃冰箱和37℃金属浴保存7天。

B： QPR303UD13 酶混合液中260ul中加入END-UD13酶混合液稀释液40ul充分混合，分别在-20℃冰

箱和37℃金属浴保存7天。25ul反应体系中酶混合液添加量提升为1.5ul。

C：QPR303UD13 酶混合液中260ul中加入END-UD13酶混合液稀释液240ul充分混合，分别在-20℃冰

箱和37℃金属浴保存7天。25ul反应体系中酶混合液添加量提升为2.5ul。

仪器设备：

伯乐CFX 96

下图标注：

绿色：-20℃保存7天，蓝色：37℃金属浴保存7天

  
    A组：QPR303UD13-1.3μl         B组： 1.5μl 酶混合液 /25μl反应

C组： 2.5μl 酶混合液 /25μl反应

 结论：QPR-303UD13经过37℃热加速后性能保持不变，通过添加END-UD13酶混合液稀释液提升酶混合液添加量到1.5ul或2.5ul时，依然保持优良的热稳定性。

【常见问题】

1. 我司原诊断试剂盒的酶和缓冲液部分更换为贵司试剂后，为何灵敏度不如原试剂盒？

  答：本公司的核心PCR酶是基于TTH DNA聚合酶改造而成，其Taqman探针切割活性及聚合酶活性均大大得到提升，二者活性比发生了变化。所以大部分场合下，原Taq酶体系的最优引物探针浓度并不适合我司的酶体系，所以必须通过<引物探针浓度正交筛选>重新筛选最优引物探针浓度组合。

2. 为了摸索最佳灵敏度，该产品引物探针浓度需要提高还是降低？

  答：最佳引物探针浓度不仅仅决定于酶体系及缓冲液成分，还受限于引物探针序列的设计，所以很难简单地说明提高还是降低引物探针浓度。必须通过<引物探针浓度正交筛选>重新筛选最优引物探针浓度组合。

3. 最佳引物探针浓度正交筛选时，每反应的拷贝数应该用多少？

  答：在高拷贝模板时很难区分浓度高低对扩增曲线的影响，如果使用已知模板拷贝数时，请使用10-50拷贝/反应进行调优实验。在此模板浓度下筛选荧光信号最高且Ct值最低的引物探针浓度组合作为最佳引物探针浓度。

4. 引物探针浓度的正交实验时浓度组合太多，如何做加样设计最有效率？

  答：为了最大提高筛选效率，减少筛选时间，我司专门设计了<正交板式引物探针浓度加样设计>的SOP文件，可极大提高筛选效率。请联系我司索取。

5. 针对超过五重以上的多重PCR，如何提高筛选效率？

  答：建议此时使用以前的引物探针浓度，使用10-50拷贝/反应进行测试与原体系对比或分析灵敏度状况。固定灵敏度符合要求的引物探针浓度后再使用<引物探针浓度正交筛选>筛选不合要求的引物探针组合，直到全部最优为止。

6. 贵司酶的混合液是否兼容其它公司的PCR缓冲液？

  答：本公司根据我司的酶的氨基残基特性进行了专门优化，其它公司的PCR缓冲液系统一般不能将我司的酶发挥到最优性能，故不建议使用其它PCR缓冲液。

7. 使用该产品进行免提取RT-PCR，为何效果不好？

  答：免提取直接RT-PCR受限于样品类型，样品保存液类型及裂解液类型，这些溶液类型会影响本产品的缓冲体系。所以建议要从缓冲液添加物进行优化来适应直扩RT-qPCR用途，主要有如下建议：

（1）缓冲液中含有体系最终浓度为2.5mM的Mg2+，如果前处理样品中含有EDTA等螯合剂，建议Mg2+在2.5-8mM之间进行优化。

（2）缓冲液中含有体系最终浓度为0.8mg/ml的BSA，为了提高荧光信号及抗抑制能力，建议BSA在 0.8-3mg/ml之间进行优化。

（3）缓冲液中含有体系最终浓度为0.01%的吐温20，为了使得病毒及细胞充分裂解和灭活，可以提升表面活性剂的浓度。建议吐温20及曲拉通100从0.01%-5%之间进行优化。

8. 使用热裂解病毒免提取RT-qPCR时，检测灵敏度为何大大降低？

  答：热裂解RT-qPCR，一般用95℃，5min进行灭活，此时RNA容易降解及片段化，从而使得容易产生假阴性。 

  具有如下两条建议：

（1）VTP培养基建议更换为我司含化学RNase抑制剂的病毒保存缓冲液（RDB-100或RDB-200），热裂解时有效减低RNA降解。

（2）PCR扩增片段设计为80bp以下，可有效检测片段化的RNA。

（3）单通道设计2-3条扩增子，提高片段RNA检测灵敏度。

9. 该产品25ul反应体系中酶混合液添加1.3ul，如何提升添加量到1.5ul和2.5ul？

  答：不建议直接用其它溶液进行直接稀释，以免降低酶混合液的热稳定性，建议使用我司END-UD13进行稀释，有效避免了对酶混合液的热稳定性影响。具体步骤为，取260ul酶混合液加入40ul或140ul稀释液，充分混合后使用。

10. 引物探针和酶的全预混液如何配制，是否能保持热稳定性？

  答：一般不建议进行全预混作为商品使用，热稳定性比酶混合液及缓冲液分开的试剂要差很多。全预混Mix经测试37℃一天，性能略下降，灵敏度不变。25℃三天，性能略下降，灵敏度不变。4℃一周性能保持不变。若通过全预混提升使用方便性建议如下：

（1）产品使用酶和缓冲液分开形式，保持运输和存储稳定性；使用时大量配制除模板外的预混液，4℃冰箱存放一周内用完。

（2）若将产品直接做成全预混液方式，建议设计具有保护的引物和探针，避免引物探针降解，从而提升产品稳定性。 配制时使用100uM的高浓度引物探针直接配制，将所有补足水的部分改为END-UD13稀释液从而提升产品稳定性。

11. 酶体系中双链核酸酶会不会影响DNA模板检测灵敏度？

  答：酶体系中微量双链核酸酶是为了去除酶体系中的潜在污染，一旦和缓冲液混合配制成引物探针预混液后，该微量双链核酸酶已经完全失活。所以继续添加模板时，不会对DNA模板造成影响。另外该核酸酶仅仅对双链DNA具有活性，RNA、cDNA及单链DNA不会产生活性。