高效率连接试剂

Ligation high

本试剂是以T4 DNA Ligase为基础开发的预混型高效率连接试剂盒。连接反应所需要的反应用buffer・rATP・DTT等已全部包含在试剂中。通过组成条件的最适化，使针对冻结/融解的稳定性和反应效率大大提高，即便反复冻融也不影响使用。使用时只需按DNA样品溶液的1/2〜同等量加入Ligation high，就可以得到比单独使用T4 DNA Ligase更好的结果。

高效率单管型连接试剂。只需与样品混合即可，非常方便！

Code No.	包装	价格	保存温度	说明书
LGK-101	375μl×2支	RMB 550	-20℃

*1次使用量为2.5μl的情况下，可使用300次。

【产品特征】

特征1　简便

只需在DNA样品中混入Ligation high，便可立即进行连接反应。用HindIII酶切末端，只需5分钟便可完成连接反应！（请参照实验例3『反应时间的探讨』）
特征2　高效率
与单独使用T4 DNA Ligase相比，可获得高50倍以上的效率。
特征3　高稳定性
经实验确认，即便反复冻融50次，也不会降低连接反应的效率。

【产品实验例】

1.盐浓度的影响

本实验探讨DNA溶液中所含的盐（NaCl）浓度对连接效率的影响。将用SacⅠ切断的pBluescript^®Ⅱ（5ng）混入不同盐浓度的TE Buffer 5μl中，以观察DNA溶液中所含的盐成分对自连接效率有多大影响。方法如下：在DN****段溶液中添加与其等量或一半量的Ligation high，16℃条件下反应30min.，取2μl用于转化，检测出现的菌落数。
结果显示，NaCl浓度越高，连接反应效率越低。
因此，对溶解在限制酶H Buffer等高盐浓度反应液的DNA用于连接反应时，建议先置换成TE buffer。

2.反应时间对PCR产品的TA克隆的影响

使用本试剂，将PCR产物插入到T载体中，观察反应时间对实验的影响。实验方法如下：先以λDNA 500bp为目的片段，用rTaq DNA Polymerase进行。将该反应液1μl (约6.4ng)和2μl的T载体(50ng)添加到3μl的Ligation high中，在16℃条件下进行不同时间的培育，再进行连接反应。然后再用各反应液2μl进行大肠杆菌转化，测定白斑和蓝斑的数量。
结果显示，反应时间越长，效率越高，16小时效果最好。2小时以上，蓝斑的数量没有明显变化，而时间越长白斑的数量越多。

因此，用Ligation high进行PCR产物的TA克隆时，如想要获得高插入率，建议反应时间在2小时以上，最好是16小时。
※想在短时间内进行TA克隆时，推荐使用Ligation high Ver.2。

3.反应时间的探讨

用λ/HindⅢ酶切，用Ligation high在16℃条件下进行各种时间的连接反应，EtOH沉淀后进行电泳。
结果可见，HindIII酶切末端，约5min.即可完成充分的连接反应。

【简要备注】

＜注意＞

●Ligation high的沉淀
本试剂中有时会出现沉淀，这是由于作为稳定剂用的BSA形成的，对连接效率没有影响。请勿加温使其溶解，直接使用即可。同时，无须混合使沉淀均质状态，直接将不含沉淀的部分用于反应即可。
*加温会导致酶失活，请注意。
●转化的适应
连接反应后，将样品用于电穿孔时，需进行乙醇沉淀或试剂盒脱盐操作。
使用CaCl₂时，连接用的DNA样品在高盐浓度的缓冲液中溶解时，也需要进行脱盐操作 。

【几点建议】
●Ligation high的使用量
通常对15μl的DNA样品中加入等量的Ligation high。将限制酶酶切的样品克隆到载体上时，如果样品纯度较高，则使用半量也能得到充分的结果。用TA克隆、琼脂糖凝胶切下的样品中建议加入等量的本品。

●反应温度/时间
通常在16℃、30〜60分钟可以得到良好的结果。TA克隆时，2小时以上比较好，最好在16小时以上（参照实验例2）。此外，效率不佳时延长时间可以得到改善，如果反应时间较长，即使在室温下进行反应也不会对效率产生影响。

【基本反应条件】

＜质粒的连接＞
DNA样品 15μl
  （DNA Fragment 20−400fmloes）
  （Plasmid  50−100fmoles）
Ligation high 15μl

16℃、30−60min.

＜噬菌体的连接＞
DNA样品 15μl
  （DNA Fragment 600ng）
  （Phage 750ng）
Ligation high 15μl

16℃、30−60min.

＜循环连接＞
DNA样品 15μl
  （DNA Fragment 100−200fmloes）
  （Linker 20−100pmoles）
Ligation high 15μl

16℃、30−60min.

备注：
双链DNA
1kb    1pmole＝660ng

【参考文献】

1) Richard L. Hawkins et al.,Current Microbiol.,38:335−341(1999)

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