【产品名称】

                           TOROIVD® 5G qPCR Premix

【产品简介】

         TOROIVD^® 5G qPCR Premix是一款快速定量PCR分析的2×预混液，可进行高灵敏高重复多重定量PCR分析。产品专门为病毒及其它样品DNA靶标的探针法（如Taqman探针）定量PCR分析设计，含有定向进化改造的TOROIVD^® 5G DNA polymerase，dNTPs及专门优化的PCR缓冲系统。通过酶的改造及缓冲优化提高了抗PCR抑制成分的能力和室温稳定性。该预混液适合高通量定量PCR分析，并且含有dUTP可配合UNG酶降低交叉污染的风险。产品适用于DNA模板的高速高精度定量分析，并可在宽泛的定量范围得到高重复的定量PCR结果。

【产品特征】

• 超高灵敏度

该产品采用探针法定量PCR对2-3拷贝模板进行高速高灵敏地分析，特别适合低拷贝病毒及低丰度基因的mRNA表达分析。

• 多重qPCR分析

该试剂可有效地进行多达五重qPCR分析，可增加模板或内参进行高效qPCR分析或试剂质量内控。

• 抗抑制能力

增强的5'-3'聚合酶活性，可进行高速qPCR或PCR检测。

• 高抗抑制能力

通过酶的改造及PCR缓冲体系双重优化，该试剂可有效抵抗临床样品中含有的PCR抑制成分，如肝素，血红素或EDTA等，可进行粗样品扩增。

• 宽泛的定量范围

该预混液具有高特异性及宽泛的定量范围，从而在不同DNA模板浓度范围下可得到可靠的结果。

• 兼容各种定量PCR仪

该预混液可使用快速或标准PCR循环在各种定量PCR仪上实现同样的扩增性能。针对使用ROX内参的仪器，我们另外提供50×ROX匹配仪器的ROX校正要求。

• 防污染PCR系统构建

该预混液含有dUTP，UNG酶，可实现防污染PCR体系构建。

【产品内容】

QPT-200含有10mL预混液，使用20μL反应体系可进行1000次反应，或25μL反应体系可进行800次反应,或50μL反应体系可进行400次反应。

【储存条件及有效期】

试剂盒-20℃冷冻保存，有效期24个月。运输过程中，温度应低于-15℃到-25℃冷链。试剂开封后，置于4℃条件下保质期为30天，-20℃条件下保质期为12个月，但反复冻融不得超过5次。

TOROIVD® 5G qPCR Premix请室温完全融化后使用，否则会降低使用效果。

【适用仪器】

CFX96、ABI7500、SteponePlus、LineGene9600Plus等型号荧光PCR检测仪。

【引物探针】

引物设计

引物长度:18–25bp；Tm值:60–65℃；GC含量:40–60%；

扩增子长度:70–200bp         纯化级别:HPLC级

探针设计

探针设计:20–30bp；Tm值:65–70℃；

GC含量:40–60%；纯化级别:HPLC级

引物探针验证：对模板进行5-8个梯度的10倍稀释，采用新设计引物探针制作标准曲线。确认PCR扩增效率在90%-110%范围内，且R²值大于等于0.99。如果不在以上范围内，循环条件需进行调整优化。如果不能改善结果，要重新设计引物和探针。

【操作流程】

反应体系配制：

1.1反应体系的配制：

1.1.1准备工作：将所有试剂室温完全融化后振荡混匀，离心6000rpm10秒。

1.1.2反应体系配制：取1.5mL无核酸酶离心管，计算需准备反应试剂人份数（n=样本数+2管对照+1管余量），按如下管以标准25μL体系为例进行总管配制，反应体系可根据实际情况进行调整使用。

配制好的总管涡旋混合，并快速离心10sec。

备注：-该预混液中已经含有反应最终浓度为2.5mM MgCl₂，可以针对绝大部分使用场合。

但是如果在以下情况，需要提高MgCl2含量保持产品性能：

（1）使用粗样品作为模板或样品直接PCR时，可能含有EDTA等螯合镁离子的物质。

（2）引物探针稀释液或纯化核酸洗脱液为TEBuffer时，含有EDTA等螯合镁离子。

（3）本酶经过进化改造其5'-3'核酸外切酶活性与5'-3'DNA聚合酶活性比发生了变化，若发挥酶的最佳灵敏度，需要在10-50copies/反应的模板下采用引物-探针浓度正交表进行优优化最佳引物探针浓度。按物探针最佳浓度配制的引物探针预混液，可以根据水的体积进行添加体积调整。

（4）50×ROX不包含在产品中，如需添加可免费配套提供。添加ROX时可与引物探针混合成Mix中使用。

（5）该产品中含有UNG或UDG酶和dUTP，无需额外添加。

1.2反应体系分管：

将反应体系按20μL/管分装至对应的PCR扩增管或板中。

1.3加样：

取5μL模板、阳性对照品及阴性对照加入以上20μL中，离心后直接上机。

备注：

-本试剂可使用各种核酸提取试剂盒或自动化仪器提取的纯核酸进行扩增。

-本试剂也可对粗样品的DNA模板或稀释后的样品进行直接PCR。

-针对抑制物不同含量需要调高Mg2+浓度来保持扩增性能。

PCR扩增检测：

将加样后的PCR扩增管分别转移到荧光定量PCR检测仪上进行扩增检测，荧光信号按探针设计进行设置。不同仪器的循环条件如下：

2.1所有仪器通用循环条件：

2.2 CFX96、SteponePlus和LineGene 9600 Plus仪器快速条件设置：

2.3 ABI7500快速条件的专业模式设置

点击开运行界面，选择菜单栏Run Methold；

设置反应体系20ul及勾选ExpertMode;然后点击SelectViewFilters,跳出菜单栏，选择Filter1和Filter4。然后按如下设置程序。

【购买信息】

【注意事项】

-开始检测前请仔细阅读本说明书全文，并严格按照要求进行操作。

-请注意将试剂完全融化后进行检测，5GPremix可能有晶体析出，需完全融化。

-实验体系配制，请尽量在单独房间，带好口罩，以免实验室气溶胶污染。

-体系配制时尽量采用带滤芯枪头进行配制，以免样品间交叉污染，影响实验结果。

-反应体系需现用现配制，否则再次使用时会影响扩增效率。

-其它仪器循环条件请自行调优。

【常见问题及分析】

问1：未见扩增曲线或扩增曲线成斜线上升？

答1：（1）使用对照试剂排查引物、探针和模板来确保引物探针正确。

   （2）试剂未完全溶解或未充分混合导致酶的扩增效率下降，请充分溶解及混匀。

问2：灵敏度未达到2-3copies/反应最佳性能？

答2：（1）引物探针设计不佳，请优化引物探针设计。

   （2）引物探针浓度不是最优，请用引物-探针浓度正交表进行优优化最佳引物探针浓度。

   （3）引物探针或模板的稀释使用TEBuffer，请适度调高Mg2+含量。

问3：低拷贝模板的荧光值和Ct值不如对照试剂好？

答3：本酶经过本酶经过进化改造其5'-3'核酸外切酶活性与5'-3'DNA聚合酶活性比发生了变化，若发挥酶的最佳灵敏度，需要在10-50copies/反应的模板下采用引物-探针浓度正交表进行优优化最佳引物探针浓度。引物终浓度调整范围0.2μM-0.8μM，探针终浓度调整范围0.1μM-0.4μM。