【产品用途】

难扩增序列PCR
高GC/AT序列PCR
粗样品直接PCR

【产品说明】

KOD FX Neo是在高成功率PCR酶KOD FX的基础上添加了「延伸增强剂」而开发的PCR酶。在保持高扩增效率的同时，进一步提高了对难扩增序列、微量模板DNA、长目的片段及粗样品的扩增效率。

【产品特征】

 特征1.延伸性UP

【产品内容】

KOD FX Neo (1U/μl)  200μl×1支

2×Buffer for KOD FX Neo*[KFX-2B] 1.7ml×3支

2mM dNTP**[NTP-201] 1ml×2支

*含有终浓度2.0mM的Mg²⁺。

** 使用本酶进行PCR时，请使用dNTPs[NTP-201]。如果使用其他的dNTPs，有时可能得不到良好的扩增性能。

※50μl反应体系的情况下可使用200次。

活性的定义:

在75℃活性测定条件下，在30分钟内摄入10nmoles的全核苷酸使成为酸不溶物时所需酶的活性定义为1U。

来源:

E.coli 重组体

【基本反应条件】

灭菌蒸馏水   X μl

2×PCR buffer for KOD FX Neo  25μl

2mM dNTPs  10μl

10pmol /μl Primer F  1.5μl

10pmol/μl Primer R  1.5μl

KOD FX Neo(1.0U/μl)  1μl

Genomic DNA  10～200ng

Plasmid DNA  1～50ng

cDNA  ～200ng(RNA相当)

粗样品  ～2μl

〈一步法植物裂解液1μl〉

Total 50μl

〈2步法循环〉*

94℃, 2min.

↓

98℃, 10sec.

68℃, 30sec./kb 25～45 cycles

〈3步法循环〉*

94℃, 2min.

↓

98℃, 10sec.

Tm℃, 30sec.

68℃, 30sec./kb 25～45 cycles

〈Step down循环〉*

94℃,2min.

↓

98℃,10sec.

74℃,30sec./kb 5 cycles

↓

98℃,10sec.

72℃,30sec./kb 5 cycles

↓

98℃,10sec.

70℃,30sec./kb 5 cycles

↓

98℃,10sec.

68℃,30sec./kb 15～30 cycles

↓

68℃,7min.

*基本上以2步法循环进行。引物的Tm值低于68℃或用2步法循环未见扩增时，请试一下3步法循环。另外，扩增10kb以上的目的片段时，如果出现Long PCR片段或非特异条带及弥散，请试一下Step down循环。

※Tm值采用最邻近法(Nearest Neighbor method)计算得到的值。引物的Tm值计算表(EXCEL)请点击这里下载。

<碱裂解法>

1) 将鼠尾(约3mm)放入离心管中。

2) 添加50mM NaOH 180μl。

3) Vortex充分振荡。

4) 95℃・10min.

5) 添加Tris-HC(l pH8.0) 20μl。

6) Vortex充分振荡。

7) 离心(12,000rpm, 10min.)

8) 取0.5～2μl上清进行PCR反应。

(鼠尾不会也无需完全溶解)

<一步法>

1) 将叶片(3mm)或精米(1粒) 放入离心管中。

2) 添加Buffer A* 100μl。

3) Vortex充分振荡。

4) 95℃・10min.

5) Vortex充分振荡。

6) 离心(12,000rpm, 10min.)

7) 取1μl上清进行PCR反应。

(植物组织不会也无需完全溶解)

*Buffer A:

 100mM Tris-HC(l pH9.5)

 1M KCl

 10mM EDTA

【几点建议】

●PCR产物的克隆

由于本酶的PCR产物已被平滑化，可用平滑末端克隆法进行克隆。此时，如已对载体进行了脱磷酸化处理，就需要对PCR产物进行磷酸化，或使用带5'磷酸基的引物。　

另外，由于本酶的PCR产物已被平滑化，不能直接进行TA克隆。可使用按以下方法开发的TA克隆专用试剂盒「TArget Clone -Plus-」。

●关于引物

扩增超过10kb的目的片段时，推荐使用OPC以上纯化级度，27mer以上的引物。另外，3'端有错配的引物，可能会受到本酶校正。

※Tm值采用最邻近法(Nearest Neighbor method)计算得到的值。引物的Tm值计算表(EXCEL)请点击这里下载。

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(单独销售的组分)