非冻融型高效率连接试剂

Ligation high Ver.2

【产品简介】

本试剂是在原产品『Ligation high』基础上改良的使用更方便的高效率单管型连接试剂。本试剂如下图所示，即便是-20℃条件下保存也不会冻结。从冷冻柜中取出后可立即使用。使用方法与原产品一样，只需在DNA样品中加入1/2〜等量的本品混合即可，非常简便。可广泛地用于突出末端、平滑末端、及TA克隆等用途。

TA克隆效率得到了飞跃性的提高！

即便在-20℃保存也不会冻结，使用非常简便。

Code No.	包装	价格	保存温度	说明书
LGK-201	750μl×1支	RMB 750	-20℃

*每次使用量为3.75μl时，可使用200次。TA克隆时Ligation high Ver.2为7.5μl。

【产品特征】

特征1.高效率
TA克隆效率得到了大幅度的提高。
在一般情况下，通过30分钟以内的反应即可获得足够的阳性克隆*。（参照实验例1）
*标准的实验步骤反应时间设定为30分钟。

特征2.即便在-20℃保存也不会冻结
从冷冻柜中取出后可立即使用。

特征3.简便的单管型
使用方法与原有产品一样，只要将试剂和DN****段混合即可，非常简便。

【产品实验例】

实验例1. TA克隆效率的比较

将T载体<50ng>与λDNA的0.5kb PCR扩增片段(用Taq DNA polymerase扩增后纯化)按1:3的摩尔比混合，16℃条件下进行30分钟的连接反应，用Competent cell DH5α转化后培养，第二天点白斑（确认插入）和蓝斑数。下图是以用Ligation high Ver.2出现的克隆数为100换算的比较图。结果可知，用Ligation high Ver.2可进行高效率的TA克隆。

实验例2. DNA末端形状与连接效率的关系

在16℃条件下反应时，将DN****段（0.5kb）的克隆效率与末端形状进行比较。结果可见，突出末端的连接约5分钟即可完成，而平滑末端及TA克隆30分钟约完成70〜80%。另外，平滑末端克隆及TA克隆时间超过1小时，到2小时为止，连接效率会逐渐提高。因此当克隆效率比较低时，可将反应时间提高至2小时左右可提高连接效率。

※各反应以60分钟后白斑数为100作为标准。

实验例3.使用未经纯化的PCR产物的TA克隆

将T载体（50ng, 25fmol）和具有良好扩增效率的未纯化PCR产物（用Taq DNA polymerase扩增的0.5kb片段）按照各种比例混合，在该DNA溶液〈7.5μl〉中添加Ligation high Ver.2〈7.5μl〉，在16℃条件下反应30分钟。然后，用10μl反应液对E. coli DH5α感受态细胞〈100μl〉进行转化，用LB/Amp（X-Gal）培养基培养后点克隆数。结果可见，尽量少带入PCR反应液可得到良好的结果。　由于用纯化后的DNA片段可得到高效率，因此当效率低下时，可使用纯化后的PCR产物。

【相关信息】

＜反应条件＞
各种用途的反应条件等，请参照产品说明书。

＜注意＞
1.在−30℃以下长期保存，或在冷冻柜的冷气出风口处保存时，可能会产生冻结现象。经实验证明，5次反复冻融不会影响试剂活性，但注意请尽量不要使其冻结。产生冻结时，可用手指捏着离心管使其融解，但注意不要使其升温。
2.产生白色沉淀时也可按照上述方法将沉淀溶解后正常使用。
3.担心有可能产生冻结时，可事先将试剂分装成若干管保存。

＜几点建议＞

• 反应时间

 一般推荐16℃、30分钟，但普通的突出末端连接通常只需5分钟即可完成。当平滑末端或TA克隆的反应效率低下时，将反应时间延长至2小时左右通常可提高连接效率。

• 反应液带入

 盐的带入会影响到连接反应。在TA克隆时，未经纯化的PCR产物的带入为0.5〜1μl（15μl反应体系）时，可获得很高的连接效率。使用MagExtractor -PCR & Gel Clean up进行纯化，TA克隆可获得更 高的效率。

• TA克隆效率

 如想获得更高的连接效率，可使用磷酸化的引物进行PCR。关于引物的磷酸化，请参照这里。

【参考文献】

1）Richard L. Hawkins et al.,Current Microbiol.,38:335−341（1999）

【相关产品价格表】