【产品用途】

基因克隆用PCR酶

定点突变用PCR酶

长片段高保真PCR

【产品说明】

KOD -Plus- Neo在高保真性PCR酶KOD -Plus-系列技术的基础上，应用了本公司新开发的「延伸增强剂」，保持了KOD -Plus-系列高保真性（约为Taq的80倍）的同时，通过抑制<停滞现象>，明显提高了对微量模板DNA、长目的片段的扩增效率。

2. β-globin基因上各种长度区域的扩增效率・延伸性的比较

以人基因组DNA（50ng）为模板，对各种长度的β -globin 基因进行扩增。反应按各PCR 酶的推荐条件，进行了30个循环。
结果显示，只有用KOD -Plus- Neo 的情况下，17.5 kb 的片段能确认得到明亮的条带。 而且，17.5 kb 以下的片段，用KOD -Plus- Neo 的得率要高得多。

【参考文献】

1) M. Takagi et al., Appl. Environ. Microbiol., 63 : 4504-4510 (1997)

2) H. Hashimoto et al., J. Biochem.(Tokyo), 125 : 983-986 (1999)

3) H. Mizuguchi et al., J. Biochem.(Tokyo), 126 : 762-768 (1999)

4) M. Nishioka et al., J. Biotechnol., 88 : 141-149 (2001)

5) H. Hashimoto et al., J. Mol. Biol., 306 : 469-77 (2001)

6) T. Imanaka et al., J. Chin. Inst.Chem. Engrs., 32 : 277-288 (2001)

【产品内容】

【KOD-401】
KOD -Plus- Neo (1U/μl)200μl ×1支
10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo [KOD-4B]1ml ×1支
25mM MgSO4[KOD-2S]1ml ×1支
2mM dNTP [NTP-201]1ml ×1支

※50μl反应体系的情况下可使用200次。

组分:
50mM   Tris-HCl (pH8.0)
25mM   KCI
0.1mM  EDTA
1mM     DTT
0.05%    Tween^®-20
0.05%    Nonidet^®P-40
50%       Glycerol 

活性的定义:

在75℃活性测定条件下，在30分钟内摄入10nmoles的全核苷酸使成为酸不溶物时所需酶的活性定义为1U。

来源:

E.coli重组体

【基本反应条件】

灭菌蒸馏水X μl
2mM dNTPs5μl
25mM MgSO43μl
10pmol/μl Primer F1.5μl
10pmol/μl Primer R1.5μl
KOD -Plus- Neo (1.0U/μl)1μl
Genomic DNA～200ng
Plasmid DNA～50ng
cDNA～200ng（RNA相当）
10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo5μl

〈2 Step Cycle〉*
94℃    2min.
         ↓
98℃    10sec.
68℃    30sec./kb 25～45 cycles

〈3 Step Cycle〉*
94℃    2min.
        ↓
98℃    10sec.
Tm℃    30sec.
68℃    30sec./kb 25～45 cycles

〈Step Down Cycle〉*
94℃    2min.
        ↓
98℃    10sec.
74℃    30sec./kb 5 cycles
        ↓
98℃    10sec.
72℃    30sec./kb 5 cycles
        ↓
98℃    10sec.
70℃    30sec./kb 5 cycles
        ↓
98℃    10sec.
68℃    30sec./kb 15～30 cycles
        ↓
68℃    7min.

*引物的Tm值高于63℃的情况下，请用两步法。

引物的Tm值在63℃以下，或用两步法无法确认到扩增时，请尝试用三步法。
此外，当扩增产物出现杂带或弥散时，请尝试Step down方法。

※Tm值采用最邻近法（Nearest Neighbor method）计算得到的值。
引物的Tm值以及扩增产物的Tm值计算请点击此处进入在线工具

【几点建议】

●PCR产物的克隆
由于本酶的PCR产物已被平滑化，可用平滑末端克隆法进行克隆。此时，如已对载体进行了脱磷酸化处理，就需要对PCR产物进行磷酸化，或使用带5'磷酸基的引物。另外，由于本酶的PCR产物已被平滑化，不能直接进行TA克隆。可使用按以下方法开发的TA克隆专用试剂盒「TArget Clone -Plus-」。

●PCR条件的设定
酶的标准使用量为50μl反应体系1U。延伸反应在68℃条件下进行，按1kb目的片段1min.的标准。出现拖尾条带时，可降低MgSO4浓度，无法确认到扩增时，可提高MgSO4浓度。 
●高GC含量的模板
反应液中添加终浓度为2〜5%的DMSO可得到改善。 
●以RT反应液为模板的情况
过量带入RT反应液有可能会对PCR反应产生抑制作用。建议带入到PCR的RT反应液在PCR反应液的1/25以下（最好在1/50以下）。这样就无需考虑RT反应液中Mg2+、
dNTPs的影响，只要按照基本反应条件添加本酶中添付的dNTPs和MgSO4即可。 

●引物的设计
3'端有错配的引物，可能会受本酶校正。

FAQ请点击这里

【相关产品】

(单独销售的组分)